La cultura figurativa toscana al tempo dei Medici è molto articolata e si muove su due direttrici principali: una legata al gusto di corte, che privilegia i temi allegorici e profani, l’altra espressione di un’arte più devota, aderente ai dettami del Concilio di Trento. Nel Museo vi sono esempi di entrambe le tendenze. Suggestioni cromatiche, colori acidi e liquidi ed enigmatiche figure femminili sono alcune caratteristiche della pittura di questo periodo, che si ritrovano ad esempio nelle Virtù di Giovan Maria Butteri, ispirate all’Iconologia di Cesare Ripa. A Raffaello e Andrea del Sarto si ispira invece il dipinto di Rodolfo del Ghirlandaio Ritratto di Baldo Magini (1450-1528), benefattore della città, al quale si deve la riapertura del Monte di Pietà. Pregevole per i colori tersi e smaltati è la Madonna con Bambino e Santa Caterina attribuita al Maestro della Madonna Parrish o a Giulio Francia. Di rilievo anche la tavola Sant’Orsola con le Vergini di Zanobi Poggini, ispirata al clima severo e conservatore del Sogliani, suo maestro. Spiccano infine le opere di Giovan Battista Naldini con la drammatica Passione di Cristo e il raro altarolo con la Sacra famiglia, realizzato in collaborazione con Giovanni Balducci.

A testimoniare la profonda influenza di Caravaggio sulla pittura del Seicento, oltre allo splendido Noli me tangere di Battistello Caracciolo, capolavoro del maestro napoletano, sono presenti altre interessanti tele. Tra queste, di scuola fiorentina, la teatrale  Semiramide, prima opera documentata di Cecco Bravo, il drammatico Ripudio di Agar di Mattia Preti, espressione del periodo romano dell’artista e il Buon samaritano di Nicola Malinconico, caratterizzato dallo stile tardo di Luca Giordano. Attribuite al Maestro del lume di candela il Cristo deriso e a Taddeo Baldini La decollazione di san Giovanni Battista.